Вплив нікотинової кислоти та комплексу германію з нікотиновою кислотою (МІГУ-1) на жирнокислотний склад ліпідів кардіоміоцитів і гепатоцитів щурів з експериментальною хронічною серцевою недостатністю

І. В. Ніженковська1, В. П. Нароха1, О. В. Кузнецова1, Т. С. Брюзгіна1, І. Й. Сейфулліна2, О. Е. Марцинко2, О. А. Чебаненко2
1Національний медичний університет імені О. О. Богомольця, м. Київ
2Одеський національний університет імені І. І. Мечникова

Першопричиною багатьох захворювань серця є порушення метаболічних процесів на клітинному й субклітинному рівнях. Для корекції порушень використовується велика кількість лікарських препаратів, які певною мірою можна віднести до мембраностабілізуючих засобів, що також зменшують накопичення вільних радикалів і активних форм кисню (АФК). Доведено зв’язок серцево-судинних захворювань (ССЗ) із жирнокислотним складом ліпідів їжі, крові, тканин [1]. Жирні кислоти (ЖК) беруть участь у біохімічних процесах у клітинах: у міокарді насичені жирні кислоти (НЖК) виконують функцію основного енергетичного субстрату [2]. У фізіологічних умовах НЖК у складі тригліцеридів (ТГ) потрапляють у клітину через апоЕ/В100-рецептори ліпопротеїдів дуже низької щільності (ЛПДНЩ) шляхом активного транспорту, який є основним, тоді як пасивна дифузія НЖК у клітину залежить від концентрації ЖК у крові [3].

Ненасичені жирні кислоти (ННЖК) як структурні компоненти фосфоліпідів мембран є важливим фактором функціонування мембранозв’язаних білків та регулювання транспорту речовин через плазматичні мембрани клітин. Крім цього, ННЖК арахідонова кислота є субстратом синтезу простаноїдів – однієї з груп регуляторів біохімічних реакцій у живому організмі. Дослідження засвідчують здатність ННЖК потенціювати оксидативний стрес [4].

Серед основних стратегій, спрямованих на зниження чисельності ССЗ, важлива роль відводиться пошуку кардіопротекторних засобів (антиоксидантні препарати; стимулятори цитопротекторів; препарати, що знижують рівень ліпідів) різної хімічної будови. Нікотинова кислота впродовж останніх 50 років широко використовується для корекції дисліпідемії та профілактики ССЗ. Численні дослідження механізму дії нікотинової кислоти, виконані in vitro та in vivo, свідчать про її здатність інгібувати активність печінкової діацилгліцеролацилтрансферази-2 – ключового ферменту синтезу ТГ, що формують ЛПДНЩ. У жировій тканині нікотинова кислота пригнічує ліполіз ТГ шляхом інгібування гормон-чутливої тригліцеридліпази. Завдяки даним механізмам нікотинова кислота здатна до модифікації ліпідного профілю плазми, пов’язаного зі збільшенням рівня ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ), зниженням ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ), ТГ [5, 6]. Нікотинова кислота проявляє антиоксидантні властивості, підвищуючи редокс-потенціал в ендотеліальних клітинах артерій. Доведено, що нікотинова кислота інгібує запалення ендотелію шляхом зниження утворення АФК і наступного окиснення ЛПНЩ, а також продукції цитокінів, ключових етапів атерогенезу [7]. Вивчення механізму розвитку вазодилатації під час прийому нікотинової кислоти показало, що вона стимулює синтез простагландинів D2 і E2 в епітеліальних клітинах Лангерганса через рецептор PR109A, який сполучений з G-білком [8].

Вищезазначене відкриває перспективи більш широкого використання лікарських препаратів на основі нікотинової кислоти для лікування й профілактики ССЗ. Особливу увагу вчених привертають нові комплексні сполуки германію з біолігандами, що відрізняються багатовекторністю фармакологічної дії та низькою токсичністю [9, 10]. Це теоретично обґрунтовує доцільність експериментального дослідження нової комплексної сполуки германію з нікотиновою кислотою за умов моделювання хронічної серцевої недостатності.

Мета дослідження – вивчити зміни жирнокислотного складу ліпідів кардіоміоцитів та гепатоцитів у щурів з моделлю хронічної серцевої недостатності та оцінити ефективність їхньої корекції за допомогою препарату нікотинової кислоти та нової комплексної сполуки германію з нікотиновою кислотою (МІГУ-1).

Матеріали та методи. Дослідження проводили на статевозрілих щурах-самцях масою 180–220 г. Догляд за тваринами (включаючи евтаназію) здійснювали згідно із Директивою Європейського Союзу 2019/10/63 EU про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та інших наукових цілей [11], і відповідно до Закону України № 3447-ІV «Про захист тварин від жорстокого поводження» [12]. Тварин утримували на звичайному збалансованому харчовому раціоні та вільному доступі до води в умовах віварію Національного медичного університету імені О. О. Богомольця.

У дослідах були використані доксорубіцин-КМП у формі ліофілізованого порошку для приготування розчину для ін’єкцій по 0,01 г (виробник ВАТ «Київмедпрепарат», Україна), нікотинова кислота (ніацин), порошок кристалічний (субстанція) (виробник Aarti Drugs Ltd, Індія) та комплекс нікотинової кислоти з германієм (лабораторний шифр МІГУ-1), уперше синтезований у лабораторії кафедри загальної хімії та полімерів Одеського національного університету імені І. І. Мечникова.

Тварин методом випадкової вибірки було розподілено на 4 групи по 10 тварин у кожній: 1 група – тварини, яким щотижня протягом 5 тижнів внутрішньом’язово вводили 0,9 % NaCl (контроль); 2 група – тварини, яким 5 тижнів вводили внутрішньом’язово доксорубіцин з розрахунку 5 мг/кг/тиждень (експериментальна хронічна серцева недостатність (ХСН) [13]; 3 група – тварини, які протягом 5 тижнів отримували внутрішньом’язово доксорубіцин на тлі внутрішньоочеревинного введення нікотинової кислоти в дозі 10 мг/кг/день (нікотинова кислота); 4 група – тварини, які протягом 5 тижнів отримували внутрішньом’язово доксорубіцин на тлі внутрішньоочеревинного введення комплексу германію з нікотиновою кислотою (МІГУ-1) у дозі 10 мг/кг/день. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом з наступною екстирпацією серця та печінки.

Газохроматографічне визначення ЖК ліпідів у тканинах. Наважку тканини кількістю 0,3–0,5 г поміщали в гомогенізатор, одержаний гомогенат переносили в мірну пробірку об’ємом 10 мл із притертою пробкою та заливали хлороформ-метаноловою сумішшю (5 мл у співвідношенні 2 : 1) (на основі методу Фолча) і витримували протягом 30 хв у холодильнику [14]. Для кращого розподілу фаз додавали 1 мл дистильованої води. Далі піпеткою Пастера відбирали нижню хлороформну фазу. Для повної реакції етап екстракції повторювали двічі. Об’єднані хлороформні екстракти концентрували випаровуванням до об’єму однієї краплі під струменем газоподібного азоту за температури 45 °С на водяній бані. До сухого осаду ліпідів додавали 5 мл 1 % розчину Н2SO4 у метанолі та переносили розчин у скляну ампулу ємністю 10 мл. Після запаювання ампули проводили гідроліз та метилування (на основі методу Синяка) у термостаті за 85 °С протягом 20 хв [15]. Екстракцію метильованих ЖК проводили двічі гексан-ефірною сумішшю (у співвідношенні 1:1) у кількості 5 мл. Для розподілу фаз додавали 1 мл дистильованої води. Верхню фазу відбирали піпеткою Пастера. Об’єднані екстракти випарювали досуха в потоці газоподібного азоту за 45 °С на водяній бані. Сухий осад розчиняли в 40–50 мкл чистого гексану та вносили у випарювач хроматографа в кількості 5 мкл. Газохроматографічний аналіз спектра ЖК ліпідів здійснювали на газовому хроматографі «Цвет-500» (Росія) з полум’яно-іонізаційним детектором в ізотермічному режимі за таких умов: скляна колонка (розміром 3 м х 0,3 см), заповнена фазою 5 % поліетиленгліколю сукцинату на хроматоні N-АW-НМDS (зернистість – 0,125–0,160 мм), температура колонки – +180 °С, температура випарювача – +250 °С, витрати азоту та водню – 35 мл/хв, повітря – 200 мл/хв, швидкість діаграмної стрічки – 240 мм/год, чутливість шкали – 10–9А, об’єм проби, яку вносили – 5 мкл, тривалість аналізу – 30 хв. Ідентифікували ЖК за піками на газовій хроматограмі, порівнюючи час їх утримання з часом утримання піків стандартних чистих речовин з відомим якісним та кількісним складом. Кількісну оцінку спектра ЖК проводили методом нормування площин піків метильованих похідних ЖК та визначали їхній склад у відсотках. Похибка становила ± 10 %.

У спектрі ЖК ліпідів кардіоміоцитів та гепатоцитів було ідентифіковано 9 найінформативніших ЖК: із них міристинова С14:0, пентодеканова С15:0, пальмітинова С16:0, маргаринова С17:0, стеаринова С18:0, що складають суму НЖК, а також олеїнова С18:1, лінолева С18:2, ліноленова С18:3, арахідонова С20:4, що складають групу ННЖК. Лінолева С18:2, ліноленова С18:3, арахідонова С20:4 ЖК входять у суму поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) і визначаються як незамінні.

Отримані результати представлено у вигляді середньоарифметичного (М) і стандартної похибки (m), з урахуванням кількісної вибірки (n). Отримані результати обробляли за допомогою U-критерію Вілкоксона-Манна-Уїтні [16]. Відмінності вважали достовірними при Р < 0,05.

Результати та їх обговорення. У кардіоцитах і гепатоцитах тварин ідентифіковано одні й ті самі вищі ЖК, що відрізняються між собою тільки своїм рівнем залежно від біологічного об’єкта. При порівнянні контрольних показників жирнокислотного складу ліпідів кардіоцитів і гепатоцитів виявлено різницю у співвідношенні НЖК, ННЖК та ПНЖК. Для кардіоцитів та гепатоцитів контрольної групи характерна підвищена ненасиченість (майже 60 %) за рахунок арахідонової та лінолевої ЖК. Рівень ПНЖК складає майже 50 % від усієї кількості вищих ЖК.

Проведені дослідження показали, що в щурів з експериментальною ХСН спостерігалися значні зміни жирнокислотного складу ліпідів у тканині серця (табл. 1). Встановлено статистично достовірне зменшення суми ПНЖК ліпідів кардіоцитів переважно за рахунок зниження вмісту арахідонової та лінолевої ЖК. Сума ННЖК достовірно не змінилася порівняно з контролем. Натомість рівень олеїнової кислоти був у 1,5 разу вищий, ніж у контрольній групі. Серед змін у спектрі НЖК слід відмітити зростання вмісту пальмітинової кислоти. Ці зміни не відобразилися на сумі НЖК: (44,1 ± 1,5) % проти (40,6 ± 1,6) % у контролі. Таким чином, доксорубіцин вплинув на вміст ПНЖК, що пов’язано з активацією реакцій перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) у клітинах, зменшенням стійкості мембран, більш легким руйнуванням клітин за дії пошкоджуючих факторів.

Таблиця 1

Жирнокислотний склад ліпідів кардіоміоцитів щурів з експериментальною хронічною серцевою недостатністю та за впливу нікотинової кислоти та комплексу германію з нікотиновою кислотою, % (М ± m; n = 10)

Жирна кислота

1 група

Контроль

2 група

Хронічна серцева недостатність

3 група

Нікотинова кислота

4 група

Комплекс германію з нікотиновою кислотою

Міристинова С14:0

2,80 ± 0,30

3,40 ± 0,50

3,20 ± 0,30

1,60 ± 0,10*/**/***

Пентодеканова С15:0

0,90 ± 0,10

0,70 ± 0,10

1,30 ± 0,10*/**

0,60 ± 0,10*/***

Пальмітинова С 16:0

21,90 ± 1,00

25,50 ± 1,00*

24,40 ± 1,00

20,80 ± 1,00**/***

Маргаринова С17:0

0,20 ± 0,05

0,30 ± 0,05

0,20 ± 0,05

0,10 ±0,05**

Стеаринова С18:0

14,80 ± 1,00

14,20 ± 1,00

16,40 ± 1,00**

14,80 ± 1,00

Олеїнова С18:1

9,90 ± 0,70

14,70 ± 1,00*

10,50 ± 0,80**

9,40 ± 0,60**

Лінолева С18:2

13,80 ± 1,00

10,80 ± 0,70*

12,40 ± 1,00**

16,80 ± 1,00*/**/***

Ліноленова С18:3

0,20 ± 0,05

0,30 ± 0,05

0,20 ± 0,05

0,10 ± 0,01*/**/***

Арахідонова С 20:4

35,50 ± 1,30

30,10 ± 1,10*

31,50 ± 1,00

35,80 ± 1,30**

∑ НЖК

40,60 ±0,60

44,10 ± 1,50

45,50 ± 1,30

37,9 0± 1,80**/***

∑ ННЖК

59,40 ± 1,60

55,90 ± 1,50

54,50 ± 1,30

62,10 ± 1,80***

∑ ПНЖК

49,50 ± 1,30

41,20 ± 1,30*

44,10 ± 1,20

52,70 ± 1,60**/***

Примітка. Тут і в табл. 2: *вірогідність відносно контролю (Р < 0,05), **вірогідність відносно 2 групи (Р < 0,05), ***вірогідність відносно 3 групи (Р < 0,05).

Вплив доксорубіцину на спектр ЖК ліпідів гепатоцитів був не такий виражений, як у кардіоцитах щурів. Суми НЖК, ННЖК і ПНЖК ліпідів гепатоцитів тварин із 2 групи достовірно не змінилися порівняно з контролем (табл. 2).

Таблиця 2

Жирнокислотний склад ліпідів гепатоцитів щурів з експериментальною хронічною серцевою недостатністю та за впливу нікотинової кислоти та комплексу германію з нікотиновою кислотою, % (М ± m; n = 10)

Жирна кислота

1 група

Контроль

2 група

Хронічна серцева недостатність

3 група

Нікотинова кислота

4 група

Комплекс германію з нікотиновою кислотою

Міристинова С14:0

1,30 ± 0,30

1,10 ± 0,30

2,20 ± 0,30**

0,80 ±0,10*/***

Пентодеканова С15:0

0,20 ± 0,05

0,30 ± 0,05

0,30 ± 0,05

0,60 ± 0,10*/**/***

Пальмітинова С 16:0

23,00 ± 1,00

25,40 ± 1,10

28,10 ± 1,30

23,60 ± 1,00***

Маргаринова С17:0

0,10 ±0,05

0,40 ± 0,05*

0,30 ± 0,05*

0,50 ± 0,10*/***

Стеаринова С18:0

14,30 ± 1,00

14,20 ± 1,00

12,60 ± 1,00

11,80 ± 1,00*/**

Олеїнова С18:1

8,00 ± 0,50

8,40 ± 0,70

9,30 ± 0,70*

6,50 ± 0,50*/**/***

Лінолева С18:2

8,40 ± 0,70

10,00 ± 1,00

8,40 ± 0,70

9,40 ± 0,70

Ліноленова С18:3

0,10 ± 0,05

0,20 ± 0,05

0,30 ± 0,05*

0,50 ± 0,10*/**/***

Арахідонова С 20:4

44,60 ± 1,50

40,00 ± 1,30

38,80 ±1,30*

46,30 ± 1,30**/***

∑ НЖК

38,90 ± 1,80

41,40 ± 1,30

43,50 ± 1,60

37,30 ± 1,60

∑ ННЖК

61,10 ± 1,80

58,60 ± 1,30

56,50 ± 1,60

62,70 ± 1,60

∑ ПНЖК

53,10 ± 1,60

50,20 ± 1,30

47,20 ± 1,50

56,20 ± 1,50***

Уведення доксорубіцину на фоні нікотинової кислоти достовірно не вплинуло на суми НЖК, ННЖК і ПНЖК ліпідів міокарда в щурів. Слід зазначити підвищення вмісту насиченої пентадеканової ЖК порівняно з групою тварин з еспериментальною ХСН у 1,8 разу і в 1,4 разу порівняно з контролем. У тканині міокарда вміст стеаринової кислоти виріс у 1,2 разу, а пальмітинової кислоти статистично достовірно не відрізнявся від показників групи тварин з експериментальною ХСН (табл. 1). Зміни вмісту досліджених в роботі ННЖК носили різноспрямований характер. Уміст олеїнової кислоти зменшився в 1,4 разу, лінолевої кислоти виріс у 1,2 разу, а ліноленової та арахідонової кислот статистично достовірно не змінився порівняно з показниками тварин 2 групи (табл. 1).

У гепатоцитах тварин із 3 групи, як і у кардіоцитах, суми НЖК, ННЖК і ПНЖК достовірно не змінилися. У печінці вміст міристинової кислоти підвищувався в 2 рази: (2,2 ± 0,3) % проти (1,1 ± 0,3) % у 2 групі, тоді як у тканині міокарда вміст цієї НЖК не змінився.

МІГУ-1 за умов експериментальної ХСН у щурів справляв більш виражену дію на ЖК склад ліпідів кардіоцитів і гепатоцитів порівняно з нікотиновою кислотою. Сума НЖК у кардіоцитах достовірно зменшилася порівняно з показниками тварин 2 і 3 груп (табл. 1). Рівень у кардіоцитах і гепатоцитах міристинової та пальмітинової НЖК достовірно був нижче, ніж у тварин із 3 групи. Сума ПНЖК у кардіоміоцитах і гепатоцитах достовірно збільшилася порівняно з показниками тварин із 3 групи. У гепатоцитах статистично достовірно виріс уміст ліноленової та арахідонової ЖК порівняно з показниками тварин з 2 і 3 груп. У тканині міокарда сума НЖК становить (37,9 ± 1,8) %, ННЖК – (62,1 ± 1,8) %, ПНЖК – (52,7 ± 1,6) %, що статистично достовірно не відрізняється від показників контрольних тварин: (40,6 ± 1,6) %, (59,4 ± 1,6) % і (49,5 ± 1,3) % відповідно. У печінці статистично достовірно не відрізнялися суми НЖК – (37,3 ± 1,6) %, ННЖК – (62,7 ± 1,6) % і ПНЖК – (56,2 ± 1,8) % від контрольної групи (38,9 ± 1,8) %, (61,1 ± 1,8) % і (53,1 ± 1,6) % відповідно.

Кардіотоксичну дію антрациклінового антибіотика доксорубіцину пов’язують з інтенсифікацією реакцій ПОЛ у клітинах, наслідком якого є дефіцит ПНЖК, головним чином арахідонової ЖК. Активація ліполізу за умов оксидативного стресу лежить в основі механізму збільшення відносного рівня міристинової, пальмітинової та олеїнової кислот у кардіоцитах щурів з еспериментальною ХСН. НЖК формують у мембрані локальні домени й неспецифічні канали, через які починається пасивна дифузія одно- і двовалентних катіонів за градієнтом концентрації: у клітину надлишково надходить натрій і кальцій, а із клітини виходить калій і магній. У відповідь компенсаторно зростає активність Nа+, К+- АТФази, Са2+-АТФази та синтез в клітинах холестерину [17]. Дисбаланс катіонів призводить до набухання клітин, збільшення об’єму, високої осмолярності цитозолю і, тим самим, затримки води в клітинах, що негативно позначається на її функціональному стані. Цей процес ускладнюється порушенням синтезу ліпідних вазоактивних медіаторів внаслідок зниження синтезу арахідонової кислоти із попередника олеїнової кислоти.

Проведені дослідження показали виражений вплив МІГУ-1 на жирнокислотний спектр ліпідів у тканині міокарда та печінки щурів з експериментальною ХСН. На нашу думку, МІГУ-1 призводить до відновлення складу ЖК ліпідів кардіоміоцитів завдяки прямій антирадикальній дії, яка призводить до зниження утворення АФК, а також протекторному впливу на ензими, залежні від НАДФ-Н, що беруть участь у рециркулюванні внутрішньоклітинного пулу глутатіону [18].

Один із механізмів реалізації впливу нікотинової кислоти на склад ЖК ліпідів кардіоцитів та гепатоцитів на фоні доксорубіцин-індукованої ХСН у щурів можливо пов’язаний із Gi-білок-опосередкованим інгібуванням активності аденілатциклази, зниженням синтезу цАМФ, що в подальшому відображається на активності цАМФ-залежної протеїнкінази А, фосфорилюванні гормон-чутливої ліпази та окисненні ТГ.

Встановлений факт впливу МІГУ-1 на склад ЖК ліпідів у тканині міокарда та печінки щурів з еспериментальною ХСН є підставою для подальшого дослідження механізмів дії МІГУ-1 за умов доксорубіцин-індукованої кардіоміопатії з можливою перспективою вивчення його як лікарського засобу з кардіопротекторною активністю.

Висновки

1. За умов експериментальної ХСН жирнокислотний склад ліпідів у тканині міокарда в щурів характеризується зменшенням ненасиченості за рахунок зниження вмісту арахідонової та лінолевої ЖК. Порушення співвідношення НЖК та ННЖК у тканині печінки щурів з доксорубіцин-індукованою ХСН не виявлено.

2. Уведення нікотинової кислоти тваринам з доксорубіциновою ХСН не впливало на процентне співвідношення НЖК і ННЖК+ПНЖК ліпідів кардіоцитів і гепатоцитів у щурів.

3. Уведення комплексу германію з нікотиновою кислотою (лабораторний шифр МІГУ-1) за умов експериментальної доксорубіцин-індукованої кардіоміопатії призводить до відновлення складу ЖК ліпідів у тканині міокарда та печінки щурів.

 

1. Plasma Phospholipid Trans-Fatty Acids Levels, Cardiovascular Diseases, and Total Mortality: The Cardiovascular Health Study [Електроний ресурс] / Q. Wang, F. Imamura, R. Lemaitre [et al.]. – Режим доступу: http://jaha.ahajournals.org/content/3/4/e000914.full.

2. Low and very low density lipoproteins: pathogenetic and clinical significance / V. N. Titov, I. A. Vostrov, S. I. Kaba [et al.] // Klin. Med. (Mosk). – 2013. – V. 91 (1). – P. 20–7.

3. Титов В. Н. Конформация апоВ-100 в филогенетически и функционально разных липопротеинах низкой и очень низкой плотности. Алгоритм формирования фенотипов гиперлипопротеинемии / В. Н. Титов, В. А. Амелюшкина, Т. А. Рожкова // Клин. лаб. диагн. – 2014. – № 1. – С. 27–38.

4. Comparative effects of curcumin and an analog of curcumin on alcohol and PUFA induced oxidative stress / R. Rukkumani, K. Aruna, P. Varma [et al.] // J. Pharm. Pharm. Sci. – 2004. – V. 7 (2). – P. 274–83.

5. Niacin increases HDL biogenesis by enhancing DR4-dependent transcription of ABCA1 and lipidation of apolipoprotein A-I in HepG2 cells / L. H. Zhang, V. S. Kamanna, S. H. Ganji [et al.] // J. Lipid. Res. – 2012. – V. 53 (5). – P. 941–50.

6. Song W. L. Niacin, an old drug with a new twist / W. L. Song, G. A. FitzGerald // J. Lipid. Res. – 2013. – V. 54 (10). – P. 2586–2594.

7. Niacin inhibits vascular inflammation via down regulating nuclear transcription factor-kB signaling pathway [Електроний ресурс] / Y. Si, Y. Zhang, J. Zhao [et al.]. – Режим доступу: http://www.hindawi.com/journals/mi/2014/263786/.

8. Nicotinic acid- and monomethyl fumarate-induced flushing involves GRP109A expressed by keratinocytes and COX-2-dependent prostanoid formation in mice / J. Hanson, A. Gille, S. Zwykiel [et al.] // J. Clin. Invest. – 2010. – V. 120 (8). – P. 2910–2919.

9. Кресюн В. Й. Фармакологічна характеристика сполук германію / В. Й. Кресюн, К. Ф. Шемонаєва, А. Г. Відавська // Клініч. фармація. – 2004. – № 4. – С. 64–68.

10. Скринінг і порівняльна оцінка протиішемічної ефективності серед координаційних сполук германію при гострій цереброваскулярній недостатності / В. Д. Лук’янчук, І. О. Житіна, І. Й. Сейфулліна [та ін.] // Фармакологія та лікарська токсикологія. – 2010. – № 1–2 (14–15). – С. 61–64.

11. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes [Електроний ресурс] – Режим доступу: http://conventions.coe.int/treaty/en/treaties/html/123.htm.

12. Закон України № 3447-ІV «Про захист тварин від жорстокого поводження» [Електронний ресурс] – Режим доступу: http://zakon4.rada.gov.ua/laws/show/3447–15.

13. Ніженковська І. В. Біохімічні та мембранні механізми ушкодження міокарда за експериментальної серцевої недостатності та її корекції фізіологічно активними сполуками метаболітної дії: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня доктора мед. наук: спец. 14.01.32 «Медична біохімія» / Ніженковська Ірина Володимирівна; Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця. – К., 2009. – 11 с.

14. Folch J. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues / Folch J., Lees M., Sloane Stanley G. H. // J. Biol. Chem. – 1957. – V. 226. – P. 497–509.

15. Синяк К. М. Метод приготовления липидов крови для газохроматографического исследования / Синяк К. М., Оргель М. Я., Крук В. И. // Лаб. дело. – 1976. – № 1. – С. 37–41.

16. Петри А. Наглядная статистика в медицине / А. Петри, К. Сэбин; пер. с англ. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2003. – 143 с.

17. Sarafidis P. A. Non-esterified fatty acids and blood pressure elevation: a mechanism for hypertension in subjects with obesity/insulin resistance? / P. A. Sarafidis, G. L. Bakris // J. Hum. Hypertens. – 2007. – V. 21 (1). – P. 12–9.

18. Metabolic coupling of glutathione between mouse and quail cardiac myocytes and its protective role against oxidative stress. / Nakamura T. Y, Yamamoto I., Kanno [et al.] // Circ. Res. – 1994. – V. 74 (5). – P. 806–816.

Theme by Danetsoft and Danang Probo Sayekti inspired by Maksimer