Розробка ВЕРХ методики визначення ізорамнетин-3-рутинозиду в лікарських засобах квіток нагідок лікарських (Calendula officinalis L.)

А. В. Гудзенко
ДУ «Інститут фармакології та токсикології НАМН України», м. Київ

Протягом останніх років у світовій фітотерапії спостерігається тенденція до поширеного використання багатокомпонентних лікарських засобів рослинного походження (БЛЗРП). Зокрема, на фармацевтичному ринку України зареєстровано та добре зарекомендували себе понад 200 полікомпонентних фітозасобів [1, 2]. Але існуючі сьогодні методики аналізу вищезазначених фітозасобів здебільшого не відповідають сучасним фармакопейним вимогам, вони не є специфічними та не дають можливості ідентифікації та визначення кількісного вмісту окремих компонентів суміші.

Одним з перспективних напрямів подальшого удосконалення процедури стандартизації багатокомпонентних фітозасобів є використання так званих маркерних сполук, або маркерів – речовин, присутність яких характерна лише для окремої лікарської сировини [3, 4]. Впровадження методик якісного та кількісного аналізу, заснованих на використанні маркерів, має не лише велике практичне значення, але й суттєву наукову доцільність.

Одними з найпоширеніших складових, що застосовуються для виготовлення БЛЗРП, є квітки нагідок лікарських, що успішно використовуються в медичній практиці як у вигляді монопрепаратів, так і у вигляді складових частин БЛЗРП [1, 2, 5, 6].

Фармакологічна активність квіток нагідок лікарських обумовлена наявністю в їхньому складі комплексу біологічно активних речовин, зокрема, флавоноїдів [5–9]. Основним представником цього класу сполук у квітках нагідок лікарських є ізорамнетин-3-рутинозид, який за даними літератури має широкий спектр біологічної активності [5–9]. Тому вважали за доцільне вивчити можливість використання ізорамнетин-3-рутинозиду як маркера нагідок лікарських при стандартизації рослинних сумішей.

Мета дослідження – розробка підходів до якісної та кількісної стандартизації квіток нагідок лікарських у рослинних сумішах за вмістом ізорамнетин-3-рутинозиду.

Матеріали та методи. Об’єктами дослідження були квітки нагідок у пачках по 50 г (виробники ЗАТ «Ліктрави» (серії: 120508, 30310, 80310), КП «Фармацевтична фабрика» (серія 20709), квітки нагідок у пачках по 25 г (виробник ЗАТ ФФ «Віола», серія 020210), квітки нагідок, фільтр-пакети по 1,5 г (виробник ЗАТ «Ліктрави», серія 20210), суміш з вмістом квіток нагідок (квіток нагідок лікарських – 1,00 г, плодів шипшини – 1,00 г, плодів та квіток глоду колючого – 1,00 г, шишок хмелю – 1,00 г, листя м’яти перцевої – 1,00 г, листя подорожника великого – 1,00 г, квіток ромашки аптечної – 1,00 г) та аналогічна суміш без вмісту нагідок лікарських.

Екстракцію біологічно активних речовин у досліджуваних об’єктах проводили наступним чином:

1,00 г (точна наважка) подрібненої сировини квіток нагідок лікарських або 5,00 г (точна наважка) рослинної суміші або полікомпонентного фітопрепарату вносили в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додавали 50 мл 50 % етилового спирту та витримували на киплячому водяному нагрівнику протягом 45 хв. Після цього екстракт охолоджували до кімнатної температури та фільтрували крізь фільтр «червона стрічка» у мірну колбу об’ємом 100 мл. Екстракцію проводили ще один раз та доводили об’єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5,00 мл отриманого розчину додавали таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 10 %, та пропускали отриманий зразок крізь попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції «Superclean lс-18 SPE Tubes 2 ml» виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивали 10 мл 10 % етилового спирту. Пробу із патрона вимивали 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрували випаровуванням до об’єму 5,00 мл та фільтрували крізь фільтр з діаметром пор 0,45 мкм.

Для визначення ізорамнетин-3-рутинозиду застосовували метод високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ).

Хроматографічне вивчення досліджуваних екстрактів та розчинів стандартних зразків проводили на хроматографі Shimadzu ser. 20, обладнаному діодно-матричним детектором, за таких умов: колонка С18 Symmetry, розміром 250 мм × 4,6 мм, розмір частинок – 5 мкм; температура колонки – 35 °С; довжина хвилі детектування – 350 нм; об’єм проби, що вводиться – 5 мкл; швидкість потоку рухомої фази – 1 мл / хв; рухома фаза: 0–25 хв: градієнтне елюювання від 95,0 % до 92,5 % суміші ацетонітрил – 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10 : 90) (об/об) та від 5,0 % до 7,5 % суміші ацетонітрил – 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90 : 10) (об/об); 25–45 хв: градієнтне елюювання від 92,5 % до 85,0 % суміші ацетонітрил – 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10 : 90) (об/об) та від 7,5 % до 15,0 % суміші ацетонітрил – 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90 : 10) (об/об); 45–50 хв: градієнтне елюювання від 85 % до 0 % суміші ацетонітрил – 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10 : 90) (об/об) та від 15 % до 100 % суміші ацетонітрил – 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90 : 10) (об/об); 50–55 хв: ізократичне елюювання 100 % суміші ацетонітрил – 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90 : 10) (об/об); 55,01–70,00 хв: ізократичне елюювання від 95 % суміші ацетонітрил – 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10 : 90) (об/об) та від 5 % суміші ацетонітрил – 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90 : 10) (об/об).

Уміст ізорамнетин-3-рутинозиду в досліджуваній суміші (у %) обчислювали за наступною формулою:

де Sпр – площина піка ізорамнетин-3-рутинозиду на хроматограмі багатокомпонентної суміші;
Sст – площина піка ізорамнетин-3-рутинозиду на хроматограмі розчину порівняння ізорамнетин-3-рутинозиду;
Сст – концентрація ізорамнетин-3-рутинозиду в розчині порівняння ізорамнетин-3-рутинозиду, г/мл;
mпр – наважка досліджуваної рослинної суміші, г;
W – втрата маси при висушуванні в досліджуваній рослинній суміші.

При виконанні роботи використовували реактиви: ацетонітрил для градієнтного хроматографування («FLUKA», Німеччина); ортофосфорну кислоту («FLUKA», Німеччина); спирт етиловий ректифікований фармакопейної якості; воду бідистильовану.

Статистичну обробку отриманих даних проводили, використовуючи t-критерій Стьюдента [10].

Результати та їх обговорення. З використанням методу ВЕРХ було розроблено методику визначення ізорамнетин-3-рутинозиду в рослинній сировині квіток нагідок лікарських.

На рисунку представлені хроматограми розчину порівняння ізорамнетин-3-рутинозиду (рисунок, А) та екстракту квіток нагідок лікарських (рисунок, Б).

Рисунок. ВЕРХ-хроматограми досліджуваних розчинів: А – розчин порівняння ізорамнетин-3-рутинозиду; Б – екстракту квіток нагідок лікарських; В – екстракту модельної суміші з вмістом квіток нагідок; Г – екстракту модельної суміші без вмісту квіток нагідок лікарських

Як можна бачити, час виходу піка ізорамнетин-3-рутинозиду в зазначених вище умовах складає близько 32,2 хв. Даний пік присутній як на хроматограмі розчину порівняння ізорамнетин-3-рутинозиду, так і на хроматограмі екстракту квіток нагідок лікарських.

За розробленою методикою були проаналізовані препарати «Квітки нагідок лікарських» різних вітчизняних виробників.

Уміст ізорамнетин-3-рутинозиду в квітках нагідок лікарських різних вітчизняних виробників надано в таблиці 1.

Таблиця 1

Уміст ізорамнетин-3-рутинозиду в досліджуваних препаратах квіток нагідок лікарських

Препарат квіток нагідок лікарських

Виробник, № серії

Уміст ізорамнетин-3-рутинозиду в перерахунку на висушену сировину, % (n = 6)

Квітки нагідок у пачках по 25 г

ЗАТ ФФ «Віола», серія 020210

0,2688 ± 0,0123

Квітки нагідок у пачках по 50 г

КП «Фармфацевтична фабрика», серія 20709

0,3540 ± 0,0167

Квітки нагідок у пачках по 50 г

ЗАТ «Ліктрави», серія 120508

0,3089 ± 0,0142

Квітки нагідок

у пачках по 50 г

ЗАТ «Ліктрави», серія 30310

0,2385 ± 0,0121

Квітки нагідок у пачках по 50 г

ЗАТ «Ліктрави», серія 80310

0,3061 ± 0,0163

Квітки нагідок у пачках по 50 г

ВАТ «Лубнифарм», серія 80410

0,3003 ± 0,0132

Квітки нагідок, фільтр-пакети по 1,5 г

ЗАТ «Ліктрави», серія 20210

0,2951 ± 0,0158

Згідно з наведеними даними (табл. 1), у всіх пробах був ідентифікований та кількісно визначений флавоноїд ізорамнетин-3-рутинозид. Уміст зазначеного флавоноїду в досліджуваній сировині складає від (0,2385 ± 0,0121) % до (0,3540±0,0167) % у перерахунку на суху сировину.

За тих самих умов був проведений аналіз рослинної сировини, що найчастіше входить до складу багатокомпонентних препаратів квіток нагідок лікарських, а саме: плодів шипшини, плодів та квіток глоду колючого, шишок хмелю, листя м’яти перцевої, листя подорожника великого та квіток ромашки аптечної.

Результати проведених досліджень дозволяють зробити висновок, що за наявністю та кількісним вмістом ізорамнетин-3-рутинозиду можна стандартизувати квітки нагідок у сумішах з усією наведеною вище сировиною.

Для підтвердження можливості стандартизації квіток нагідок лікарських за наявністю та вмістом ізорамнетин-3-рутинозиду в присутності зазначеної вище сировини була виготовлена суміш наступного складу: квіток нагідок лікарських – 1 г, плодів шипшини – 1 г, плодів та квіток глоду колючого – 1 г, шишок хмелю – 1 г, листя м’яти перцевої – 1 г, листя подорожника великого – 1 г, квіток ромашки аптечної – 1 г. Також була виготовлена суміш, аналогічна за складом попередній, але без додавання квіток нагідок.

Зазначені суміші були проаналізовані за розробленою хроматографічною методикою. Хроматограми розчину порівняння ізорамнетин-3-рутинозиду, екстрактів зазначених сумішей та екстракту квіток нагідок лікарських надані на рисунку.

Як на хроматограмі екстракту квіток нагідок лікарських (рисунок, Б) так і на хроматограмі рослинної суміші з вмістом нагідок (рисунок, В) присутній пік ізорамнетин-3-рутинозиду, тоді саме як на хроматограмі рослинної суміші без вмісту нагідок лікарських (рисунок, Г) даний пік відсутній.

Таким чином, виходячи з отриманих даних, у рослинних сумішах, до складу яких входять квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, плоди та квітки глоду колючого, шишки хмелю, листя м’яти перцевої, листя подорожника великого та квітки ромашки аптечної, квітки нагідок можна стандартизувати за наявністю та вмістом ізорамнетин-3-рутинозиду.

Метрологічні характеристики кількісного визначення ізорамнетин-3-рутинозиду в рослинній суміші з вмістом нагідок лікарських, наведено в таблиці 2. Відносна похибка методу, розрахована методом математичної статистики для 5 паралельних визначень ізорамнетин-3-рутинозиду в вищезазначеній суміші з надійністю Р = 0,95, становить 3,43 %.

Таблиця 2

Метрологічні характеристики кількісного визначення ізорамнетин-3-рутинозиду в рослинній суміші, що містить квітки нагідок лікарських

Знайдено ізорамнетин-3-рутинозиду, %

х–

S

Р

t (P, f)

ср

e%

0,0410

0,0439

0,0434

0,0430

0,0419

0,04264

0,00117

0,95

2,78

0,00146

3,43

Висновки

1. З використанням методу ВЕРХ розроблена методика визначення ізорамнетин-3-рутинозиду в моно- та багатокомпонентних фітопрепаратах квіток нагідок лікарських.

2. За розробленою методикою були проаналізовані препарати «Квітки нагідок лікарських» різних вітчизняних виробників. У всіх пробах було ідентифіковано та кількісно визначено флавоноїд ізорамнетин-3-рутинозид. Уміст зазначеного флавоноїду в досліджуваній сировині складає від (0,2385 ± 0,0121) % до (0,3540 ± 0,0167) % у перерахунку на суху сировину.

3. Встановлено, що за наявністю та вмістом ізорамнетин-3-рутинозиду квітки нагідок лікарських можна стандартизувати в сумішах з такою рослинною сировиною: плодами шипшини, плодами та квітками глоду колючого, шишками хмелю, листям м’яти перцевої, листям подорожника великого та квітками ромашки аптечної.

 

1. Довідник лікарських засобів, зареєстрованих в Україні станом на 01.01.2014 // www.Pharma-center.kiev.ua.

2. Справочник «Компендиум-2011 – лекарственные препараты» / Под ред. В. Н. Коваленко, А. П. Викторова. – К. : Морион, 2011. – 2270 с.

3. Гудзенко А. В. Реалізація сучасних підходів до стандартизації полікомпонентних фітопрепаратів / А. В. Гудзенко, О. О. Цуркан, Т. В. Ковальчук // Фармакологія та лікарська токсикологія. – 2012. – № 5 (30). – С. 99–106.

4. Гудзенко А. В. Використання речовин-маркерів – сучасний підхід до стандартизації багатокомпонентних лікарських засобів рослинного походження / А. В. Гудзенко, О. О. Цуркан, Т. В. Ковальчук // Фармацевтичний журнал. – 2011. – № 5. – С. 87–91.

5. Календула лекарственная (Calendula officinalis L.). Аналитический обзор Ч. 1 / Б. М. Зузук, Р. В. Куцик, С. М. Калугина [и др.] // Провизор. – 2001. – № 4. – С. 29–31.

6. Календула лекарственная (Calendula officinalis L.). Аналитический обзор Ч. 2 / Б. М. Зузук, Р. В. Куцик, С. М. Калугина [и др.] // Провизор. – 2001. – № 5. – С. 29–31.

7. Куркин В. А. Флавоноиды из цветков календулы./ В. А. Куркин, О. В. Шарова // Химия природных соединений. – 2007. – № 2. – С. 179–180.

8. Antiinflammatory, anti-tumor-promoting and cytotoxic activies of constituents of Marigold (Calendula officinalis) flowers / M. Ukiya, T. Akihisa, K. Yasukava [et al.] // J. Nat. Prod. – 2006. – V. 69. – P. 1692–1696.

9. Vidal-Ollivier E. Flavonol glycosides from Calendula officinalis flowers / E. Vidal-Ollivier // Planta Med. – 1989. – V. 55. – P. 73.

10. Лапач С. Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel / Лапач С. Н., Чубенко А. В., Бабич П. Н. – К. : «Морион», 2000. – 320 с.

Theme by Danetsoft and Danang Probo Sayekti inspired by Maksimer